GENEL MİKROBİYOLOJİ

Kemoterapi: Herhangi kimyasal bileşiğin bir hastalığın iyileştirilmesi veya bir enfeksiyonun yok edilmesi için sistemik olarak vücuda verilmesine kimyasal bileşiklerle tedavi anlamına gelen kemoterapi adı verilir. Bir kimyasal bileşiğim bu amaçla kullanılabilmesi için selektif toksisite adı verilen özel bir davranış göstermesi gerekir.  Yani hasta organıizmanın hücrelerine hiç zarar vermeden (veya tahammül edilebilir düzeyde zarar verir) yok edilmek istenen enfeksiyon etkenine üremeyi durdurmak veya  yaşamını devam ettirememe düzeyinde etki etmelidir. Sonuç olarak insan veya hayvan vücudundaki parazit yok edilir ve enfeksiyon ortadan kaldırılmış olur.            Selektif toksisitenin ilk tarifi Paul EHRLİCH tarafından yapılmıştır. Buna göre kullanılan kimyasal madde parazit canlıya mümkün olan en üst düzeyde zarar verirken konak canlıya ve onun hücrelerine mümkünse hiç zarar vermemelidir. Böylece enfeksiyon hastalıkları tedavi edilebilir.  Paul EHRLİCH bu gözlemini beygir frengisi etkeni olan trypanosama equiperdum isimli parazitin Trypon kırmızısı boyasından etkilenmesini incelerken fark etmiş ve bu tanımı yapmıştır. Beygir hücrelerinin bu boyayı sitoplazmalarına almalarına rağmen trypozomun bu boyanın sitoplazmasına geçişini engelleyemediğini ve vücuduna dolan bu boya yüzünden öldüğünü fark etmiştir. 1935 yılında Sülfanamide keşfedilmiş ve çok kısa bir süre içerisinde enfeksiyon hastalıklarına kemoterapi uygulaması bir patlama yapmıştır. 1912 ‘de Flemming penisilin etkisini gördüğü halde bu ilaç ilk defa 1940’ta tedavi amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Bir kaç yıl içinde bakterilerden, actinomisedlerden ve mantarlardan elde edilen ve antibiyotica adıyla anılan yüzlerce bileşik keşfedilmiştir. Antibiyotik bir canlının sentezlediği ortamda bulunan veya bulunabilecek olan diğer organizmaların çoğalmalarını engellemek üzere ortama verilen biyolojik bileşiklerdir. Günümüzde yarı sentetik veya tam sentetik antibiyotiklerde kullanılmaktadır. Antibiyotiklerin herhangi bir zaman diliminde etkilendiği organizmaların çoğu zamanla bu bileşiklerden etkilenmemeye başlarlar. Buna antibiyotik dirençliliği adı verilir. Kemoterapide kullanılan antibiyotik bileşiklerinin etki mekanizmaları aşağıdaki gruplardan birine uyar.

1) Önemli bileşiklerle kimyasal benzeri (analog) üremeyi durdurmak ; örnek sülfanamidler.             Canlılarda her enzim kendisi için özel bir substratlarla ilişki kurarak bir reaksiyonu kataliz eder. Reaksiyon sona erdiğinde meydana gelen üründen ayrılarak yeni bir substrat molekülü bağlanmaya hazır hale gelebilir. Herhangi bir kimyasal madde kimyasal striktür  olarak bir enzimin substaratına çok benzerse enzim buna bağlandığı zaman reaksiyonu gerçekleştiremediği gibi onun kendi aktif merkezinden uzaklaşmasını da sağlayamayınca saf dışı kalmış olur. Enzimleri tükenen canlı üreyemez veya yaşamını devam ettiremez. Sülfanamidler kimyasal benzerlikleri sebebiyle bir çok maddenin folik asit sentezleme aşamalarında önemli bir metabolit olan p.amino-benzoik-asit(PABA) yerine buna özel enzimi bağlanır ve enzimi saf dışı bırakırlar. Enzimden ayrılsalar bile hücrenin içi o enzimleri sürekli meşgul eden bir yığın yabancı bileşikle dolar.( yanlış kurulmuş folik asitler). Hayvansal hücreler folik asit sentezlemezler. Folik asidi dışarıdan hazır olarak aldıkları için sülfanamidlerin onlara zarar vermeleri söz konusu değildir. (Selektif toksisite tamdır ). Sülfanamidlerin etkileri bakteriostatiktir. Besiyerine bol miktarda (PABA) ilave edilirse bakteriler tekrar üremeye başlayabilirler. Tüberkiloz sülfanamidlerden hiç etkilenmezler. Buna karşılık p.amino-salisilikasit bunları yüksek düzeyde inhibe ederler. Yapılan araştırmalarda pas’tan etkilenlerin sülfanamidlere, sülfanamidlerden etkilenlerin ise pasa dirençli olduğu görülmüştür. Demek ki mikro organizmaların  pürin bazı sentezleme yolunda oluşturmak zorunda oldukları folik asitdin sentezi sırasında ya PABA için farklı konfigürasyon gösteren yada tamamen farklı enzimler kullanılmaktadırlar. Böylece sülfanamidin uyum gösterdiği bölgeye pas girememektedir. Trimetokrin, protozoaların ve bakterilerin di-hydrofolikasit redüktase enzimlerini etkileyerek bunlar üzerine son derece yüksek inhibasyon etkisi yapar. Memeli hayvanlarda bu işle görevli enzim trimetokrinden hemen hemen hiç etkilenmez. Sülfanamidlerle, trimetokrinin parazit protozonlarla bir çok bakteride folik asit sentezi yolu üzerinde ard arda yerleşik iki farklı reaksiyonu bloke ettikleri bulunmuştur.            Birlikte kullanılırlarsa bağırsak enfeksiyonlarında, idrar yolları enfeksiyonlarında ve sıtmada çok başarılı sonuç verirler.

2) Bakteri duvar sentezinin bloke edilmesi:            Penicline’ler ve cephalosporineler. Bakteri vucudunu korse gibi sararak osmotik basınç dengesizliklerine karşı lizi olmaktan koruyan bakteri duvarı memeli hayvan hücrelerinde bulunmayan bir yapıdır. Gr (+) bakterilerinin sitoplazmik osmotik basınçlarının, Gr(-) bakterilerinkinden 3-5 kat fazla olduğu bulunmuştur. Bakteri duvarının sağlamlığı peptidoglikan veya murein adı verilen özel bir molekülden kaynaklanır. (örgülü dev bir çatkı ).Penisilin ve sefarosilinler murein sentezi sırasında iskeleti oluşturan yan bağları yapacak olan tetrapeptit zincirlerinin bağlantı kurmasını engellerler. İskeletin uzamına ipliklerini oluşturan N-asetilglikozamin ve N-asetilmuramikasit oluşumu bu antibiyotikler tarafından herhangi bir etki görmez. N-asetilmuramikasit moleküllerinin komşu  iplikler arasında birbirine bağlanmasını sağlayan tetrapeptit yan zincirler başlangıçta pentapeptit zincirler şeklinde sentezlenirler. Bu zincir diğer ucuyla komşu ipliğin  N-Asetilmuramikasit molekülleri bağlanırken zincirin en sonundaki D-Alanin kopmak zorundadır. Buna transpeptidasyon reaksiyonu denir. Reaksiyonu gerçekleştiren enzim transpeptidazdır. Penisilin ve sefarosilinler, Acyl-D-Alany-D-Alanin bileşiğine çok benzemeleri sebebiyle transpeptidaz enzimini aldatırlar ve saf dışı bırakırlar. Murein çatkısı kurulamadığından hücre patlar. Görüldüğü gibi bu iki antibiyotikte sadece yani murein bileşiklerini sentezlenirken etki gösterebildiklerinden bölünmeyen bakteri hücrelerine zarar veremezler. Her iki antibiyotikte önce staphlococlarda keşfedilmiş ancak daha sonralarıda birçok Gr(-) bakterilerde üretildiği fark edilmiş ve B-Lactamase kolayca parçalanır ve imha edilirler. Zamanla B-Lactamase moleküllerine yapışmayı çok seven penisilinler bulunmuştur. B-lactamase bunları parçalayamaz veya bunları çok uğraşarak parçalayabilirler. Kombine tedavi adi verilebilen farklı antibiyotiklerin birlikte kulanılmaları  şeker uygulamalarda claxaciline birlikte transpeptidaz enzimle üzerine çok etkililer. Ancak  B-Lactamase büyük zarar görebilen ampiciline birlikte verilebilirler. Peniciline veya calaxaciline ortamdaki veya hücredeki B-Lactamase enzimi  molekülleri kuşatıp meşgul ederken  ampiciline bu fırsattan yaralanıp murein sentezini bloke eder. Bacitracin, Novobiocin, ve Venacomycine bir çok antibiyotik murein sentezinin membranda üretebilen ilk aşama bileşiklerinin oluşmasını engelleyerek etkili olurlar.(erken protein sentezi )

3) Membran fonksiyonlarını bozarak etki ederler.Herhangi bir hücrenin plazma membranı onun dış dünyayla ilişkisini kontrol eden en önemli yapılardan biridir. Herhangi bir hasar sebebiyle selektif permabilitesi bozulacak olursa hücre çok değerli bileşiklerini pürin ve primidin bazları içinde tutamaz ve yaşamını yitirir. Polymyxine, polyen antibiyotikler, bakteri ve mantar membranlarının yapılarına selektif müdahale ederek bunların fonksiyonlarını bozarlar, bakteri ve mantarların çoğalmasını inhibe ederler. Bu iki antibiyotikten biri diğerinin etki ettiği __________________ phosphatidyle thonolamin sadece bakteri membranlarına özgü bir bileşik olan fosfotidil etanolamin ile raksiyona  girerek bakteri membranını harap ederler. Ökaryotlarda bu bileşik bulunmadığından polymixine bunlara zarar veremez. Mantarlarda ökaryottur. Polyen antibiyotikler yapısında sterol bulunan membranlara bağlanırlar. Bunların fonksiyonlarını bozarlar mantar membranlarında bol miktarda sterol vardır. Fakat bakteri membranlarında hiç sterol  bulunmaz dolayısı ile  polyen antibiyotikler ancak sıkı hastane koruması altında uygulanabilirler.

4)Chloromphenicol,Tetracycline,Macrolida antibiyotikler ve Aminoglycosida antibiyotikler memeli hayvan hüc. Bakteri hücreleri arasındaki sitolojik yapı farklılıklarına dayanarak etki ederler. Selektif toksisiteleri ökaryot ribozomu ile prokaryot ribozomu moleküler düzeydeki yapısal farklılıklarına dayanır. Memeli hayvan hücresinin ribozonları 70s liktir ve her iki grubunda taşıdıkları protein alt birimler  birbirinden farklıdır. Chloromphenicol bakteri ribozomunun 50s lik alt birimine bağlanır. Sentezlenmekte olan proteinin uzamakta  olan a.a bağlanmasını engeller. Etkisinin peptidil transferaz enzimini bloke etmesinden kaynaklandığı sanılmaktadır. Bakteriostatik etkilidir. Ortamdan kaybolduğu zaman bakteriler tekrar üremeye başlarlar. Chloromphenicole dirençli olan bakteriler chloromphenicolasetiltransferaz adı verilen bir enzim üretirler. Chloromphenicol ü parçalayıp etkisiz hale getiritler. Bu yetenek bazı bakterilerde plazmid adı verilen ekstrakromozomal genetik elamanlar üzerindedir ve konjugasyon yoluyla bakteriden bakteriye yayılabilir. Tetracycline’ler 30s lik alt birime bağlanarak bakteri ribozomuna aminoasit taşıyan tRNA nın sokulmasını ve 30s lik alt birimle ilişki kurmasını engellerler. Tetracycline lerin  plazma membranından bol miktarda geçmesi bakterinin hassasiyetini ifade ederken bu antibiyotiği sitoplazmasında biriktirme yani onu plazma membranından içeri sokmayan bakteriler tetracycline dirençlidir. Bu özellik kromozom kökenli olabildiği gibi bazen plazmid üzerinde bulunur ve diğer bakterilere geçebilir. Makrolida antibiyotikler Erhtromicine ve Oleandomycine dir. Bakteri rübozomunun 50s lik alt birimine bağlanır. Buraya aa. Yaklaşmasını ve bağlanmasını engellerler. Büyük bir olasılıkla translokasyon ________________________. Makrolitlere direnç 50s lik alt birime bu antibiyotiklerin bağlanması için gerekli olan proteinin değişmesine ve kaybolmasına bağlıdır. Antibiyotik bağlanacak yer bulamayınca etkide göstermez. Ayrı bir gruba giren Lincomycine antibiyotiği  50s lik alt birime bağlanarak makrolit antibiyotiklerinin etkisine benzer  bir davranış gösterirse de daha erken protein biyosentez aşamalarını ve özellikle initasyon(başlangıç) aşamasını bloke ettiği kabul edilir. Dirençlilik bağladığı proteinin modifikasyonundan kaynaklanmaktadır. İsimleri birbirinden farklı olsada etki mekanizmaları tamamen aynı olan Konomycine, Gentomycine, Streptomycine, Tobramycine, Neomycine gibi antibiyotikler bakteri ribozomunun 30s lik alt birimine bağlanır ve burada okunmakta olan mRNA daki şifrenin yanlış tercüme edilmesine sebep olurlar. Gerekli a.a yerine yanlış bir a.a taşıyan enzimler  hatalı çalışırlar veya iş göremezler. Tetracycline’ler  ve makrolida  antibiyotikler gibi bunlarda bakteriostatik etki yaparlar ve ortamdan uzaklaştırılırlarsa bakteriler tekrar üremeye başlarlar. Bazı bakteriler bunları parçalayan veya modifize eden enzimler salgıladıklarından dirençli olurlar genellikle kromozomal kökenli bir dirençlilik şeklinde ortaya çıkar. Diğer bir fenomen ise bunların 30s lik alt birimine bağlanacakları proteinin modifize olmuş olmasıdır. Genellikle kullnılan antbiyotik dozuna bağlı olmadan bir seferde ve tam dirençlilik şeklinde gelişen bu dirençliliğe tek adım dirençliliği veya streptomycine dirençliliği tipi adı verilir. Neisseria Meningitidis’in bazı mutant suşları gerekli enzimlerinin hatalı a.a taşıması sebebiyle düşük sayıda üreyebildiklerinden bulundukları boğaz floralarında sorun yaratmazlar. Bunların bulunduğu ortamlara ve insanlara streptomycine verildiğinde  normalde hatalı olarak okunan aminoasitlerin tekrar hatalı okunması sonucu doğru a.a zincirine sokulursa bu bakteriler hızla üreme yeteneği kazanırlar ve tehlikeli enfeksiyon yaratabilirler.

5) Nükleik asit sentezinin bloke edilmesi:Actinomycine DNA sentezini ve dolayısıyla DNA ile ilgili her türlü reaksiyonu kuvvetle bloke eden antibiyotiklerdir. DNA’nın dezoksiguanozin redikallerine kuvvetle bağlanarak DNA molekülünü tamamen kuşatır. İki iplik hiçbir şekilde gereken yerlerden ne replikasyon nede transkripsiyon için ayrılmadığından her şey durur.Mitomycine DNA’yı ilmek ilmek depolimerize eden çok etkili bir antibiyotiktir. Ancak her ikiside gerek bakteri gerek virüs gerekse memeli hayvan DNA’ları arasında fark gözetmeden etkili olduklarından sadece araştırma amaçlı kullanılabilirler. Asla ilaç olarak kullanılmazlar.

Antibiyotik(Antimikrobik Madde) Dirençliliğinin Gelişme Şekli

1)Mikroplar antibiyotiği daha vücüt dışında iken parçalayarak etkisiz hale getirirler. Genellikle peniciline dirençliliği şeklinde tanımlanan bu dirençlilik tipi özellikle Gr(-) bakterilerde çok adımlı (doz arttıkça artan dirençlilik) dirençlilik tipi şeklinde karşımıza çıkabilir. Chloromphenicol’e karşı aynı mekanizma ile dirençlilik görülür. Aminoglikozit antibiyotiklere karşı görülen modifize edici enzimlerden kaynaklanan dirençlilikte bu gruba girmektedir.

2)Mikroorganizmalar ortamdaki antibiyotiklere karşı permeabilite bariyerleri kurup onu vucutlarına almayabilirler. Tetracycline dirençliliği bu yöndeki en güzel örnektir. Bunun yanı sıra polimixinlere olan dirençlilikte buna benzer.

3)Mikroplar genellikle bir mutasyon sonucu kalıcı bir değişiklik ve antibiyotiğin etkili olabilmesi bağlanması gereken noktada ki yapıyı değiştirir veya yok ederler. Bu durumda tek adımlı streptomycine tipi dirençlilik ortaya çıkar. Macrolida antibiyotikler 50s lik alt birime, aminoglikozid antibiyotikler 30s lik alt birimde antibiyotiğin bağlanacağı proteinin değişmiş olması sebebiyle etkisiz  hale gelirler.

4)Bakteriler normalde takip ettikleri biyosentez yolunu değiştirebilirler veya bundan vazgeçerler. Antimikrobik bileşiğin bloke ettiği biyosentez davranışı değişince rekabet edilecek bileşik kalmaz ve dirençlilik ortaya çıkar. Sülfanamid’e dirençli olan bakteriler çoğu kez folik asit sentezleme davranışlarını değiştirirler tıpkı memeli hayvan hücreleri gibi madur veya yarı madurfolik asit derivatları(öncü bileşik) dışarıdan hazır olarak alırlar. PABA’ya ihtiyaç kalmadığından sülfanamidin rekabet ortamı yok edilmiş alabilir.

5)Mikroplar gerçek substratını çok daha iyi tanıyan enzimler sentezlemeye başlarlar. Bu durumda antabolist davranmak isteyen bileşikler daha iyi tanındıkları için enzimleri aldatamazlar. Bazı sülfanamid  dirençli bakterilerde ki enzimleri doğal substratları olan PABA’yı sülfanamidlere göre 400 kat daha iyi tanıdıkları bulunmuştur.            Mikroorganizmalarda görülen dirençliliğin orjini iki farklı şekilde karşımıza çıkar. Bunlardan biri daha çok o anlık modifikasyon şeklinde açıklayabileceğimiz çevresel faktörlerden kaynaklanan dirençlilik halidir. Penisilinlerin etkili olabilmeleri için bakterilerin mutlaka çoğalma eğiliminde olması lazımdır. Üremeyen bakteriler bu antibiyotikten etkilenmezler. Vücudun çevresel osmotik basıncı izotoniğe yakın bölgelerinde penisilin veya sefalaspolin etkisiyle duvarlarını kaybetmiş(L-Formuna dönüşmüş) bakteriler ortam koşulları bozulmadıkça duvarsız olarak çoğalmaya devam ederler. Bunların tedaviden etkilenmemesi ve varlıklarını sürdürememesi fenomenine persiste etmek denir. Çevresel faktörlerden kaynaklanmayan yada doğal yada sonradan oluşmuş bazı genetik özellikler sebebiyle dirençli hale gelmiş mikroorganizmalarda bu davranış kromozomal kökenli olabilir. Özellikle gr(-) bakterilerin dirençlilik plazmidleri  tehlikeli tablolar oluşturur. 1976 yılında Japonya’da chloromphenicol’e tetracycline ,stroptomycine ve amplicyline dirençlilik geni taşıyan plazmidlere sahip Shigella bakterileri ortaya çıkmıştır. Bunların konjugasyon yoluyla bu plazmidleri E.Coli bakterilerine aktardıkları bulunmuştur.

Çapraz Direnç

Birbirine kimyasal akraba olan antibiyotikler arasında bunlardan birine dirençlilik söz konusu ise aynı organizmanın diğerlerine de dirençli olduğu çok yüksek bir olasılıktır. Örneğin Neomycine/Konamycine, Erhthromycine/Oleandomycine ve Polymyxine-B/Colistin dirençlilikleri böyledir. Ender olarak Eritromisin/Lycomycine kimyasal olmadıkları halde çapraz direnç gelişmesi görülebilir.

Çapraz direncin gelişmesini önlemek için:

a)Tedaviye yeterli yüksek dozda başlamalı ve bir jenarasyondaki mikropların mümkün olan en büyük kısmını yok etmelidir.

b)Genel anlamda dirençlilik gelişimini engellemek amacıyla farklı noktalarda ve birbirini destekleyecek şekilde etkili olan en az iki antibiyotiğin veya iki antimikrobik bileşiğin birlikte uygulanması mesela tüberküloz tedavisinde Ethambutol+isoniasid birlikte verilirse tedavi çok başarılı olur.

c)Antibiyotikleri antibiyogram yapmadan kullandırmamak gereklidir. Bu taktirde düşük dozda kısa sürede yeterli tedavi sağlanır.

İmmünoloji-Seroloji

Memeli hayvan ve insanların vücutlarına genellikle protein karakterli virüsler dahil olmak kaydıyla çeşitli mikroorganizmaların ve ayrıca ister makroskobik ister mikroskobik parazitler ilk kez girdiklerinde kendilerine karşı özel bileşiklerin sentezlenmesine yol açıyorlarsa bunlara çok genel anlamda antijen adı verilir. Aslında antijenlere karşı insan ve memeli hayvan vücutlarında sentezlenen özel bileşiklerin genel adı ise antikordur.            Genellikle vücuda ilk kez giren antijene karşı 8-10 gün sonra serumda saklanabilecek düzeyde antikor üretilir. Böylece örneğin enfeksiyon etkenine karşı bir savunma davranışı uygulanır. Bir enfeksiyon hastalığında vücudun ortaya koyduğu bu savunma mekanizmasını geniş kapsamlı sonucu o enfeksiyona karşı bağışıklık şeklinde karşımıza çıkar. Bağışıklığın oluşmasıyla ilgili araştırmalar yapan bilim dalı immünolojidir. Bağışıklık reaksiyonları sırasında ortaya çıkan antikor dahil her türlü özel bileşiğin in-vitro koşullarda saptanmasında bazen de in-vivo olarak bazı reaksiyonların incelenmesine ait tekniklerle uğraşan bilim dalı ise seroloji olarak tanımlanır. Serolojik reaksiyonlar araştırılan özel bileşiklerin ve yapıların karakterine bağlı olarak bazen deney tüpünde bazen jel ortamında zaman zamanda florasan mikroskobuyla gözlenebilecek ortamlarda yapılır. Prensip olarak hastanın serumunda söz konusu olabilecek patojen mikroorganizmaya karşı antikorların bulunup bulunmadığı varsa ne kadar antikor bulunduğu araştırılır. Bazı antikorlar enfeksiyonun ilk devresinde ortaya çıkar fakat kısa bir süre sonra serumdan kaybolabilirler. Bazı antikorlar ise oldukça  geç ortaya çıkarlar ama yıllarca serumdan yüksek seviyede varlıklarını sürdürebilirler.

Aglütinasyon Reaksiyonları: Bu reaksiyonun ismi aglütinojendir. Bu hücreler veya partiküller üzerinde bulıunur. Serumda bunlara karşı bulunan homolog antikorların ismi aglütinindir. Partiküller veya hücrenin üstünde ki aglütinojenler serumda ki homolog aglütininleri ile karşılaştıkları zaman hücreler veya partiküller irili ufaklı kümleler oluşturarak çökerler. Bu olaya aglütinasyon denir. Aglütinasyon reaksiyonlarında bakteri süspansiyonları kullanılmaktadır.(antijen olarak). Süspansiyondaki bakterilerin hiçbir sebep yokken kendiliğinden birbirlerine yapışması yalancı pozitif sonuçlar doğuracağından bu problemi ortadan kaldırmak için aglütinasyonda kullanılacak bakteri süspansiyonları fizyolojik tuzlu su ile hazırlanır. Aglütinasyon testlerinin uygulamasında genellikle 37 C bazende 50-55 C gibi sıcaklıklar tercih edilir. 36-37 C memeli hayvan vücut sıcaklığını yansıttığından daha güvenilir sonuçlarda alınır. Serum elde etmek için genellikle kol bileğinden 5 ml kan almak yeterlidir. Kan steril bir tüpe boşaltıldıktan sonra eğik olarak pıhtılaşması sağlanır daha sonra pıhtı steril bir cam bagetle kenardan ayrılır ve serum dikkatle toplanır. Alınan serumu steril bir şişeye aktarıp gerekirse eritrositlerden kurtarmak üzere santrifüj etmek uygundur.

Antijenlerin Hazırlanması: ağırlıklı olarak rutin çalışmalarda karşılaşacağımız organizmalar bakteriler olduğundan bakterilerden antijen hazırlamak için aşağıdaki metodlar kullanılır. Bakteri antijenleri esas olarak 2 tanedir. H antijeni adı verilen antijenler kirpikli bakterilerde bulunur. O antijenin kirpikli olsun kirpiksiz olsun bütün bakterilerde bulunan vücut antijenidir. Birde insanlardan geni izole edilen Salmonella bakterilerinde  bulunan ve ancak birkaç ay gibi kısa bir süre için saptanabilen Vi-antijeni bulunur. Vi-antijeni insan topluluklarında tifo partiküllerini saptamak için faydalıdır.

H Antijenin Hazırlanması: Bakterilerin hareketli olması gerekir. Gerekirse yavaş hareketli suşlar % 0,4’lük yumuşak agarlı B.Y giderek hareketleri güçlendirilebilir. Bakterinin S koloni yapan hareketli suşu alınır 37 C 24 saatlik Buyyon kültüründen petri kutusunda K.B.Y ‘de ekim yapılır. Bol miktarda B.Y’ne ekilen bakterinin tüm yüzeyde bir tabaka şeklinde üremesi sağlanır.(24 saat). Daha sonra petri kutusunun içine birkaç damla steril fizyolojik tuzlu su koyulur. B.Y’den parça koparmadan bakteriler sıyrılır ve koyu bir süspansiyon haline getirilirler. Steril pipetle steril bir tüpe aktarılan  bu süspansiyona % 0,1 ile % 0,2 düzeyinde formalin katılıp çalkalanır. 24 saat buzdolabında bekletilir ve daha sonra sterilite kontrolü yapılır. Formalin bakterilerin taşıdıkları  O-antijenini yok eder. Böylece süspansiyonda H-antijenleri kalır. Sterilite sağlanmış ise uygun tamponlu sıvılarla standart bulanıklığa ayarlanan süspansiyon buzdolabında aylarca kalır ve kurumaya başlar.

O-antijeninin Hazırlanması: Bakterilerin mümkünse hareketsiz suşları seçilir, buna imkan yoksa bakteri içerisine 1/800 veya 1/400 düzeyinde fenol katılmış jeloz B.Y’ne eklenerek kirpiksiz üremesi sağlandığı gibi varsa Vi-antijenini de yok edilmesi sağlanır. 37 C’de 24 saat kadar bir tabaka şeklinde üretilen bakteriler steril fizyolojik tuzlu su içerisinde koyu bir süspansiyon haline getirilirler. Bu süspansiyonun hacminin 10-20 katı hacmi de %95’lik alkol süspansiyonuna katılır ve bakterilerin taşıyabilecekleri H-antijenleri yok edilir. Alkollü karışım 40-50 C yarım saat kadar bekletilir, daha sonra bir gece karanlıkta oda sıcaklığında tutulur alkolün uzaklaşması için santrifüj edildikten sonra üst kısım atılır çöken bakterilerin uygun miktarda steril fizyolojik tuzlu suda süspansiyon haline getirilirler. Süspansiyona % 0,25 düzeyinde kloroform kullanarak konserbasyon sağlanır. Bu haliyle buz dolabında saklanır. Kullanılacağı zaman uygun sulandırmada uygun süspansiyonlar hazırlanır ve kullanılır. Testin yapılışı 8 tane tüp alınır. 1.tüpe 0,9 ml diğer tüplere  0,5 ml steril fizyolojik tuzlu su konulur.  Hasta serumundan 1. tüpe 0,1 ml konur tüp çalkalanır  bu karışımdan 0,5 ml alınarak 2. tüpe konur. Tüp çalkalanır. Bundan alınan 0,5 ml üçüncü tüpe konulur ve bu böyle 7 tüpe kadar devam eder. 7. tüpten alınan 0,5 ml karışım atılır, daha sonra tüplerin hepsine 0,5 ml antijen konur tüpler çalkalanır ve 1/3’ü suya batacak şekilde benmary’e konulur.(aglütinasyon testleri daima su banyosunda yapılır). H aglütinasyonu arıyor isek 37 C 2 saat oda sıcaklığında yarım saat tutmamız genellikle yeterlidir. O aglütinasyonu aradığımızda  37 C 4 saat bekledikten sonra genellikle oda sıcaklığında ve karanlıkta 1 gece (24 saat olabilir) beklettikten sonra sonuçlar okunur. 8.tüpte sonucun (-) olması lazımdır. Bu tüpte pozitif görüntü varsa test geçersizdir çünkü bizim antijen bozuktur.(serum olmayan tüpe pozitif sonuç verdiği için).

Sonuçlara Bakılması: Negatif sonuçta süspansiyonda ki bakteriler tüpün dibinde son derece ince ve düzgün kenarlı düğme görüntüsü veren  bir çökelti yapar. Pozitif sonuçlarda ise bakteriler irili ufaklı yumaklar oluşturarak kenarları girintili çıkıntılı kalın bir çökelti halinde dipte toplanırlar çoğu kez görüntü tüpün kenarlarına doğru tırmanmış görünür. H aglütinasyonunda kümeler büyüktür tüp çalkalandığı zaman  bunlar daha küçük parçalara dağılırlar. O aglütinasyonunda ise kümeler küçüktür çalkalanma ile dağılmazlar. Tüp çalkalandığı halde üst sıvının berrak kalması sonucun (++++) olduğunu gösterir. Hafif kullanılan (+++) yarı yarıya kullanılan (++) kümelerin hemen tamamen  dağılıp dipte sadece az bir miktar sağlam çökelti kalması (+) olarak değerlendirilir. Staphylococ ve Streptococ gibi bakterilerin tuzlu su veya buyyon süspansiyonları sulandırılmış veya sulandırılmamış hasta serumu ile lam üzerinde 1 er damla şeklinde karıştırılırlarsa kısa sürede gözle görülebilir veya mikroskobun küçük objektifi ile ayırt edilebilir. Aglütinasyon meydana getirebilirler. Kantitatif olmayan bu aglütinasyon testine lam aglütinasyonu adı verilir.

Brucella Antijeninin Hazırlanması: Brucella bakterilerinin antijenleri ortak olan abartus suis ve meditensis türleri çok yaygındır. Brucella  antjenlerini hazırlamak için genellikle abortus türü kullanılır. Büyük petri kutularına veya geniş yüzey sağlanan özel şişelere dökülmüş jeloz B.Y üzerinde bakterilerin 48 saatlik kültürü hazırlanır. Birkaç damla steril fizyolojik tuzlu suda koyu bir süspansiyon haline getirildikten sonra % 0,5 fenol veya formalin katılarak sterilizasyon sağlanır. Bir gece bekletildikten sonra sterilite kontrolü yapılır. Sterilite sağlanmış ise uygulama bulanıklığına ayarlanıp kullanılır.

Gruber Widal Testi

Tifo enfeksiyonlarının teşhisinde kullanılacak kadar tifo geçirmiş insanlarda serumda ki antikorların saptanması amacıyla yapılan bir testtir. Enfeksiyonlar en çok salmonella typhi ve salmonella paratyhphi-B ile meydana geldiğinden bu testte kullanılan antijenler bu bakterilerden hazırlanabilirler. Tifo enfeksiyonunda O-Aglütininleri, H-Aglütininlerinden daha erken ortaya çıkarlar fakat spesifik değildirler. Yani salmonella tyhpi’mi yoksa salmonella parathypi-B suşuylamı enfeksiyon geçirilmekte olduğunu belli edemezler. H Aglütininleri ise hem spesifiktirler hemde serumda sadece bir yıl kadar kalabilen O-Aglütininlerine göre daha yıllarca varlıklarını sürdürürler. Sağlıklı insanların 1/40-1/50 sulandırılmış serumları bu testte (+) sonuç verdiğinden en az 1/100 ve daha yukarı sulandırılmalar yapılmalı ve sonuçlar değerlendirilmelidir. Kişinin serumunda O-Aglütininleri 1/100  H-Aglütinleri 1/200 titresinde bulunuyorsa o zaman kişinin hastalık geçirmekte olduğu düşünebilir. Bir süre sonra her iki aglütinin grubu da daha yüksek düzeylere çıkar. Eğer kişinin serumunda O-Aglütinasyonu 1/200 H-Aglütinasyonu 1/400 gibi yüksek bir düzey gösteriyorsa o kişi kısa bir süre önce tifo geçirmiştir. Serumunda sadece H-Aglütinasyon titresi (+) olan (1/100-1/200) insanların ya aşılanmış olduklarına yada iki veya daha fazla yıl önce tifo geçirdiklerine karar verilir. Tifo ile bağlantısı olmayan herhangi bir ateşli hastalıkta  Gruber Widal testinde etkili olan H-Aglütininlerinin bir miktar arttığı bulunmuştur. Tifo portörlerinde Gruber Widal testi (+) sonuç verir. Bazen serumda çok yüksek düzeyde antikor bulunduğu halde yaptığımız aglütinasyon testinde serumu fazla sulandırmışsak isek aglütinasyon meydana gelmez. Buna Prozon olayı denir. Aynı serumu daha ileri düzeyde sulandırdığımız taktirde aynı antijenle  mükemmel antijen meydana gelecektir. Neden kaynaklandığı tam olarak bilinmiyorsa da özellikle buruccella enfeksiyonları gibi prozon olayının görülme ihtimali olan durumlarda serum sulandırmalarını 1/400’den daha fazla en iyisi 1/800 kadar yapmak tavsiye edilir.(Buruccella enfeksiyonlarında Sub-Kronik devreye girdiği zaman serum sulandırmaları 1/1000 ile 1/10000 oranında (+) sonuç verebilir. Prozon olayına sebep olan faktörlerin hasta serumunun 56 0C’de 30 dk. tutulmasıyla kısmen veya tamamen elimine olduğu ileri sürülmektedir. Ancak en etkili tedbir yüksek düzeyde  sulandırma yapmaktır çünkü yüksek sıcaklıkta serumdaki antikorlarda bozulabilirler.

Bakteri Hemaglütinasyonu

Bir çok bakteri Rickettsia, bazı mantarlar ve virüslerin bazıları çeşitli tipteki omurgalı hayvan eritrositlerini aglütine etme yeteneğindedirler. Bu olaya kısaca Bakteri Hemaglütinasyonu denir. Çoğu kez bakteriler söz konusu eritrosit süspansiyonlarıyla karşılaştıklarında ayrıca bir katkı gerçekleşmeksizin eritrositleri aglütine ederler. Bakterilerin bu davranışında tüm bakterilerde görülebilen ve adına Fimbria denilen ince ve sert yüzey eklentilerinin yol açtığı kabul edilir.(Fimbria’lar Gr(-) bakterilerde yaygındır). Bu olay direkt bakteri hemaglütinasyonu olarak tanımlanır. Bakteri hemaglütinasyonunun  2.bir tipinde bakterilerin yüzey antijenlerini oluşturan polisakkarit kökenli bileşikler eritrositlerin yüzeyine yapışırlar. Ancak aglütinasyon meydana gelmez. Bu karışıma kullandığımız bakteriye karşı homolog antikor taşıyan bir serum ilave edilirse eritrositlerin aglütine olduğu görülür. Buna İn-direkt Bakteri Hemaglütinasyonu denir. Eritrositlere yapışan ve antikorlaral tepkimeye girerek onların aglütine olmasını sağlayan polisakkarit kökenli bileşiklere Eritrosi Hassaslaştıran Madde (ESS) adı verilir.

Presipitasyon Reaksiyonları

Serolojik testler de herhangi bir partikül üzerine bağlı halde olmayan çözelti haldeki antijenlerle hasta serumunda bulunan ve yine çözelti halindeki antikorların uygun sulandırmaları ile birbirine karıştırmaları durumunda başlangıçta ortamda bulunmayan küçük partiküllerin meydana geldiği bunların birleşmesiyle , birleşmesi sonucu bulanıklık şeklinde görünen bir çökelmenin oluştuğu bilinmektedir. Bu olaya Presipitasyon denir. Bunu meydana getiren antijenlere Presipitinojen antikorlara Presipitin adı verilir. Antikor ve antijen çözeltilerinin optimal presipitasyon verdiği sulandırma düzeylerine Optimal oran adı verilir. Bu oran korunduğu taktirde presipitasyon elde etmemiz her zaman mümkündür. Örneğin daha önceki çalışmalarımızda elimizdeki antijenin 1/100 sulandırılmış şekli ile standart (+) serumların 1/20 sulandırılmış şekillerinin birbiri ile karışması durumunda optimal presipitasyon oluştuğunu bulmuş olalım. Aynı antijeni 1/200 sulandırdığımız taktirde yine optimal presipitasyonun elde edilmesi serumu 1/40 sulandırmamız yeterlidir. Presipitasyon testlerinde antijen çözeltileri çok pahalıdır. Mümkün olan en az düzeyde antijen kullanılması hedeflenir. Bu amaçla Mikropresipitasyon yöntemi geliştirilmiştir. 50-100 mikrolitre kapasiteli kapiller pipetler önce hasta serumuna daldırılır kapiller çekim yüksekliğinin yarısına kadar doldurduktan sonra antijen çözeltisine daldırıp bir miktar antijen çözeltisi kapiller tüpün içine çekilirse fiziksel karışım etkisinde kalmadan iki sıvının birbirine temas ettiği yüzeyde karşılıklı diffüzyon gerçekleşir. Bu sırada antijenle antikor arasında optimal oranın sağlandığı bölgede presipitasyon bandı(halkası) meydana gelir. Daha sonraları jel difüzyon teknikleri adıyla bilinen jeloz bulunan ortamlarda diffüzyon esasına dayanan uygumlalar geliştirilmiş. Bu teknikler kendi içinde ikiye ayrılır.

1.
Antijen veya antikordan sadece birinin düffüze olduğu basit diffüzyon sistemleri ile
2.
hem antijenin hem antikorun ortama diffüze oldukları çift diffüzyon sistemleridir.

Her iki sistem kendi içinde tek yönlü ve İki yönlü olmak üzere iki tipe ayrılır.             1.a)Tek yönlü basit diffüzyonda serum karıştırılmış jeloz deney tüpünün içine konur katılaştıktan sonra üzerine antijen çözeltisi ilave edilir. Üst kısımdan vertikal yönde jeloz içine diffüze olan antijenler optimal oranın sağlanmadığı noktada presipitasyon bandı meydana getiriler.            1.b) iki yönlü basit difüzyonda içine serum katılmış jeloz petri kutusuna dökülür. Katılaştıktan sonra jeloza açılan bir oyuğa antijen çözeltisi daldırılır veya antijen çözeltisi emdirilmiş bir filtre kağıdı parçası jelozun üzerine yerleştirilir. Antijen hem vertikal hem horizontal yönlerde jeloz içine diffüze olur. Optimal oranın sağlandığı yönlerde presipitasyon çizgileri meydana gelir.

2.a)Tek yönlü çift difüzyon sisteminde tüpün içine önce serum katılmış bir miktar jeloz konur. Katılaşması beklenir. Bunun üzerine ikinci tabaka olarak içine hiçbir şey katılmamış bir miktar jeloz konularak katılaşması beklenir. Son olarak tüpün içine bir miktar antijen çözeltisi konulur. Serum alttan yukarıya doğru antijen yukarıdan aşağıya doğru ara bölgedeki jeloza diffüze olurlar. Optimal oranın sağlandığı yerde presipitasyon bandı meydana gelir.

2.b) İki yönlü çift difüzyon uygulamasında içine hiçbir katkı yapılmamış jeloz petri kutusuna dökülür katılaştıktan sonra petri kutusunun kenarlarından ve birbirinden uygun uzaklığa yerleştirilmek üzere test edilecek serumların emdirildiği filtre kağıtları jeloz üzerine yerleştirilir. Kutunun tam ortasına da antijen emdirilimiş filtre kağıdı konur. Hem antijen hem de serumlar hem horizontal hem de vertikal yönlerde jeloza diffüze olur. Optimal oranın sağlandığı bölgelerde presipitasyon çizgileri meydana gelir. Bir tek antijen çözeltisi aynı anda 4-6 farklı seruma karşı kullanma olanağı verdiğinden bu teknik en tasarruflu uygulamadır. Günümüzde tek yönlü basit difüzyonu anımsatan fakat elektrik akımı yardımıyla antijenin serum katılmış jeloz ortamında horizontal olarak sürüklenmesini sağlayan immün elektroforez tekniği kullanılmaktadır.

Kompleman Birleşme Reaksiyonları

Kompleman bütün memeli hayvan serumlarında bulunan bir serum birleşmesidir. İmmünolojik reaksiyonlarda çok önemli bir görevi vardır. Aralarında ayrım yapılmaksızın vucudun neresinde bir antijen ve onun homolog antikoru arasında bir ilişki kurulmuş ise (Antijen-Antikor kompleksi) kompleman bu kompleksin üzerine yapışır ve bu üçlünün bulunduğu bölgede var olan membranlar veya biyolojik çatkılar tahrib edilirler. Örneğin bakterilerde yapılan bir aglütinasyon testinde hasta serumunda ki kompleman önceden yok edilmiş ise aglütinasyon meydana geldiği taktirde kısa süre içinde bakterilerin eridikleri görülecektir. Her antikor-antijen birlikteliği komplemanı bağlamasada çoğu kez kompleman bağlanması görülür ve vücüdun yüksek organizasyonlu parazitlere karşı en önemli bağışıklık reaksiyonlarından birini oluşturur. Tıpkı presipitasyon reaksiyonlarında olduğu gibi antijen-antikorun her ikisininde çözelti halinde birbirleriyle karşılaştığı ortamlarda da ortamda kompleman varsa meydana gelen antijen-antikor kompleksine bağlanır. Ancak ortamda lizi olduğunu gözleyebildiğimiz hücreler yoksa biz bu reaksiyonu saptayamayız. Oluşturduğumuz karışımda da bulunan antijen ve antikorun birbirinin homoloğu olduğunu ve ortamda kattığımız komplemanında  ortamda ki antijen-antikor kompleksine bağlandığını görünür hale getirmek için biz deneyin son aşamasında ortama koyun eritrositleri ile bunlara karşı tavşanlardan elde edilmiş anti-serum karışımını ilave ederiz. Tavşan serumu+koyun eritrositi karışımı Hemolitik Sistem adıyla bilinir. Hemolitik sistem antijen-antikor-kompleman arasındaki ilişkinin görsel olarak ortaya konulmasına yardımcı olur. Kompleman birleşmesi deneyleri diğer reaksiyonlarla varlıkları anlaşamayan bazı antikorların antijenleri ile karşılaştıklarında komplemanı bağlama özelliklerinden faydalanarak yapılarlar. Bunlar arasında en tanınmışı Wassermann testidir. 1906 yılında frenginin teşhisi ve tedavinin başarı yönünden kullanılmak üzere tarif edilmiş bir testtir. Çok sayıda kobaydan serum alınıp karıştırılarak hemoliz yeteneği ön testlerle saptanan komplemandan wassermann testinde belirili bir miktar kullanılır. Bu testi ilk tarif ettiğinde wassermann frengili bir fetusun karaciğerinin sudaki ekstraktıını antijen olarak kullanmıştır. Daha sonraları sağlam insan karaciğerinden,sığır kalbinden,sığır böbreğinden antijen hazırlanabileceği anlaşılmıştır. Günümüzde sığır kalp kasının alkolde ki ekstraktı kullanılmaktadır. İçerisinde bir miktar Lecitin katıldığında hassasiyeti daha da güçlenmektedir. Kalp kasının alkolde eriyen ana asetonda erimeyen bu ekstrakt fragsiyonunu nasıl olupta treponema pallidum antijeni yerine geçtiği tam olarak anlaşılmamıştır. Kabul edilen  bir teoriye göre bu antijen Reagnin adı verilen ve frengili hasta serumunda bulunan bir miktarda birleşmektedir. Komplemanda bu antijen-antikor kompleksine bağlanmaktadır. Reagnin nasıl meydana geldiği şu şekilde açıklanmaktadır. Treponema pallidum ürediği dokuları harab etmektedir. Hücrelerden lipoid karakterli bazı bileşikler serbest kalmaktadırlar. Bu lipoidler orada bulunan spiroket proteinlere yapışarak hapten rolü oynayıp proteinlerle birlikte oluşturdukları bu yeni yapıya karşı antikor ulaşmasını başlatmaktadırlar. Bu antikorda Reagin’dir. Wassermann testi için kullanılan komplemana uygun miktarlarda antijen alınmaktadır.            Test iki aşamada yapılır.1.Aşama da biri test diğeri kontrol olmak üzere alınan iki tüpe aşağıdaki materyal konur.                                                           Test                                                     Kontrol  1/5 hasta Serumundan    1 Hacim                                                                   1 HacimAntijen                                          1 Hacim                              1 Hacim fizyolojik tuzlu suKompleman                                  1,25 MHD                                                 1 MHD         Bu üç materyal tüplerde karıştırılır.37  0C benmary de 1 saat bekletilir. Sonra her iki tüpe hemolitik sistem  test tüpüne 2 hacim kontrol tüpüne 2 hacim 37  0C    30 dk. bekletilir ve sonuç okunur. Wassermann testinin sonuçları incelenirken hareket noktamız 1.aşamada oluşan reaksiyonların sonunda ortama ne kadar serbest kompleman kaldığıdır. 2. aşamanın sonunda ortaya çıkacak görüntünün serbest kalmış kompleman miktarı ile doğru orantılı olarak değişeceği unutulmamalıdır. Hasta serumunun içerisinde ne kadar antikor olduğunu bilmemize gerek yoktur. Önemli olan bizim birbirlerine orantılı olarak tüplere ilave ettiğimiz antijen kompleman ve hemolitk sistemdeki koyun eritrositleri ile bunlara karşı tavşanlardan elde edilmiş antikorların miktarları önemlidir. Bu oranlar daha önce yapılan araştırmalardan elde edilen sonuçlara göre seçilmişlerdir. Wassermann testinin sonucu 3 şekilde karşımıza çıkar.1-        Bütün eritrositler sağlamdır: Bu görüntü bize test tüpüne hemolitik sistem katıldığı anda ortamda hiç serbest kompleman bulunmadığını gösterir. Hemolitik sistemin içindeki koyun eritrositleri ile tavşan serumu antikorları kompleks oluşturmuş olsalar bile bu komplekslere bağlanacak kompleman olmadığından bütün eritrositler lizi olmadan kalmıştır. Demek ki 1 aşamada verdiğimiz antijen ———————————————- hasta serumu antikorla birleşmiş ve antijene orantılı olarak karışıma ilave ettiğimiz komplemanın tümü bu komplekslere bağlandığından ortamda serbest kompleman kalmamıştır. Deneyin sonucu hasta açısından (++++)’dir. Yani hasta kişi tam anlamıyla ölebilir.2-        Eritrositlerde çeşitli düzeyde lizi görülmektedir: Bu sonuç eritrositlerin sağlam kısmı azaldıkça 1 aşamadan 2 aşamaya o denli fazla miktarda serbest kompleman kaldığını ve dolayısıyla hasta serumunda o denli az antikor bulunduğunu gösterir. Eritrositlerin bir kısmı lizi olmuş çoğu sağlam ise (+++)’dir. Eritrositler yarı yarıya lizi olmuş sonuç (++)’dir. Eritrositlerin büyük çoğunluğu lizi olmuş birkaç tane eritrosit var ise sonuç (+)’dir.3-        Bütün eritrositler lizi olmuşlardır: Testin 1 aşamasında hasta serumuna ilave ettiğimiz antijen serumda kendisi için homolog olan antikor bulunmadığı için kompleks  oluşturamamamıştır. Karışıma ilave ettiğimiz kompleman bağlanacak komplejs bulamadığından tamamıyla serbest halde bulunmaktadır. 2.aşamada ortama ilave edilen hemolitik sistemin antikor yapışmış eritrosit yüzeylerine ortamda ki kompleman bağlandığından ve kompleman bağlanmamış eritrosit kanladığından bütün eritrasitler lizi olmuşlardır. Sonuç kişi hasta değildir.(-)

Flouresan Antikor Tekniği  : U.V ışık ile karşılaştıklarında sarı-yeşil ışık kaynakları şeklinde görülen bazı boyalar belirli antikorlarla bağlandıklarında bu antikorların homologu olan antijenlerin flouresans veren (sarı-yeşil ışıldayan) duruma gelmelerini ve tanınmalarını sağlarlar. En çok kullanılan 2 flouresan boyası

1.
Flourecin İzocyonat
2.
Flourecin İzotiyonat’tır

Özellikle virüslerin veya derin dokulardaki parazitlerin veyahut ta spiroketler gibi kolay boyanmayan mikroorganizmaların çeşitli muayene maddelerinde veya dokularında görünür hale getirilmesi için kullanılır. Çok hızlı bit teşhis metodudur. Ancak çok ender olarak hatalı sonuç verebilir.

Kapsül Şişmesi Reaksiyonu: Kapsüllü bakterilerin muayene maddelerinde veya kültürlerde kapsül antijenlerine karşı antikor taşıyan serumla karşılaştıklarında kapsüllerini normalden birkaç kat daha görüntü verecek şekilde şiştiği fark edilmiştir. Diploccoccus pneumoniae (pneumoccoccus) menenjitlerin hızla teşhisi için çok uygun bir testtir. Ayrıca bu bakteriler arasında tip tayini yapmamızada yardım eder. Muayene maddesi veya kültürden alınan örnek lamın üzerine yayılır havada kurutulur. Kuruyan preparatın uygun bir bölgesine içinde pneumoccoccus antijenlerine karşı antikor bulunan 1.damla serum damlatılır ve metilen mavisi çözeltisinden bir miktar bu serumla karıştırıldıktan sonra  preparat bir lamel ile kapatılır. 5-10 dk. bekledikten sonra mikroskopta muayene edilen preparatta maviye boyanmış bakterilerin etrafında geniş bir boyanmamış kapsül bölgesinin görülmesi bakterinin pneumoccoc olduğunu gösterir. Kapsül bölgesi ince kalmış ise bakteri pneumoccoc değildir. (-) sonuçlarda preparatın 1 saat sonra tekrar incelenmesi tavsiye edilir.

Deri Duyarlılık Deneyleri

Aşırı Duyarlılık: Bazı enfeksiyonlarda enfeksiyon etkeninin vucutta bulunup bulunmadığı anlaşılmadığı gibi varsa vucudun neresinde yerleşmiş olduğuda klorik serolojik yöntemlerle gösterilememektedir. Ancak varlığı araştırılan mikroorganizmaya ait kültür ekstraktları yahutta bu mikroorganizmayla hastalanmuş hayvanlardan elde edilen doku ekstraktları bu mikrooraganizmayı taşıyan kişilerin derilerine verildiği taktirde deride aşırı bir tepki ortaya çıkmaktadır. Bu tepki kızarıklık ve birkaç gün süren yarım ile bir cm çaplı bir sertlik şeklinde kendini belli eder. Buna aşırı duyarlılık denmektedir. Mycobacterium Tuberculosis’i insan vucudunda bulunup bulunmadığını veya insan bu bakteriyle karşılaşıp karşılaşmadığına bağlı olarak yapılan deri hassasiyet testlerine Tüberkülin testleri adı verilir. İnsan veya sığır tipi tüberküloz mikrobunun %4’lük gliserinli besiyerinde 6 hafta üretildikten sonra B.Y’nin 70 0C sıcaklıkta tutularak hacminin 1/10’u kalacak şekilde yoğunlaştırılması tüberkülin elde etmek için takip edilen yoldur. Bu şekilde konsantre hale getirilmiş kültür 100 0C 1 saat (30dk.-1saat) tutulduktan sonra steril filtreden süzülür ve artık Old Tüberkülin olarak adlandırılır. Old tüberkülin bazı insanlarda başka yönde alerjik tepkilere yol açtığından günümüzde tüberkülin testleri çok daha hassas ve yan etkisiz preparat olan P.P.D’ler ile yapılmaktadır.(Purifred Protein Derivates=Arıtılmış protein türevleri). Old tüberkülinin 1/10000 sulandırılmışının 0,1 ml’sinde 0,01 mg tüberkülin vardır. Buna bir tüberkülin ünitesi denir. Tüberkülin testleri yaklaşık olarak 5 ünite tüberkülin ile yapılır. (-) sonuç alınırsa 100 tüberkülin ünitesi ile tekrar edilir.            Tüberkülin testlerinde (+) sonuç tüberkülin uygulanan bölgede deride en az yarım cm çaplı sertlik ve kızarıklık şeklinde kendini belli eden ve (+) sonuçta o kişinin daha önce mycobacterium tuberculosis ile karşılaştığını ve bu bakteriye karşı belirli bir düzeyde reaksiyon geliştirdiğini gösterir. Bu kişilere aşı uygulanmaz. (-) sonuçta tüberkülin verilen bölgede herhangi bir reaksiyon görülmez buda bize o kişinin 2 ay öncesine kadar tüberküloz mikrobu ile karşılaşmadığını gösterir. Bu kişiler aşılanır.

Mono Testi: Ön kol derisi asetonla temizlenir buraya sulandırılmış veya düşük düzeyde sulandırılmış tüberkülinden 1:1 lanolin karıştırıldıktan sonra derinin üzerine damlatılıp bu bölge 1 dk. kadar ovuşturulur. Aynı testi tüberkülini bir parça filtre kağıdı damlatıp kağıdı temizlenen deri bölgesine koyup bir flaster ile kapatmakla mümkündür. 48 saat sonra tüberkülin uygulanan deri bölgesi incelenir. Deride küçük sert kabarcıklı bir kırmızılık görülmesi (+) sonucu gösterir. (-) sonuçta hiçbir reaksiyon görülmez.

Pirquet Testi: Ön kol derisi alkolle temizlenir derinin üzerine sulandırılmış veya sulandırılmamış tüberkülinden bir damla damlatılır sonra sivri uçlu temiz bir iğne ile önce damlaladan 1 kaç cm uzağa yarım cm uzunluğundan ve birbirinden 2mm kadar uzakta duran iki çizgi çizilir. Daha sonra aynı işlem damlanın bulunduğu yerde tekrar edilir. Sadece epidermisin çizilmesine dikkat edilmelidir. Test ileri üç gün sonra değerlendirilir. Yarım ile 1 cm sertlik şeklinde damlanın bulunduğu bölgede reaksiyon reaksiyon görülmesi (+) sonuçtur. (Tüberkülin damlatılmayan yerdebu görüntü yoktur). Herhangi bir reaksiyon görülmemesi (-) sonuçtur.

Mantoux: Deri içine uygulanan bu test en güvenilir sonucu vermektedir. Tüberkülin yaklaşık 1/20000 düzeyinde sulandırılır ve bunun 0,1 ml temizlenmiş ön kol derisi içine enjekte edilir. (+) sonuç 2-3 gün sonra görülür yaklaşık 1-2 cm bir sertlik şeklinde kendini belli eder . (-) sonuç alındığında daha az sulandırılmış tüberkülinden 0,1 ml enjekte ederek testi tekrar edebiliriz. Deri altına tüberkülin kaçırmamaya dikkat edilmeli.

Volmer Testi: Tüberkülin damlatılmış bir flaster kullanılır genellikle sternum derisine uygulanır. Flaster temizlenmiş sternum derisi üzerine yapıştırılıp 48 s